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Accueil > UMR 7242 Biotechnologie et signalisation cellulaire (Jean-Luc Galzi) > Intégrité du génome et biologie tumorale (Animation scientifique : Valérie Schreiber) > Modifications post-traductionnelles et cancérogenèse (Bruno Chatton) > Nos thématiques > Présentation

Présentation

Implication des MPT dans la régulation de l’activité du facteur de transcription ATF7

ATF7 est un facteur de transcription qui, comme Jun et Fos, fait partie des protéines de réponse précoce à un stress cellulaire. Cette réponse est dérégulée dans les tumeurs et les cancers comme le mélanome. En particulier, l’activité de ce facteur est modulée au cours du cycle cellulaire par des modifications post-traductionnelles spécifiques.

Nos études sur les modifications post-traductionnelles d’ATF7 ont permis de décrypter plusieurs étapes de son mécanisme d’activation transcriptionnelle. La SUMOylation d’ATF7 induit sa séquestration au niveau de la membrane interne du noyau dans des zones transcriptionnellement inactives et bloque sa diffusion dans le nucléoplasme ainsi que son interaction avec TAF12 (Hamard, 2007). Suite à un stress, ATF7 est deSUMOylé et phosphorylé par un mécanisme faisant intervenir successivement deux protéine-kinases. Ces phosphorylations ont pour effet d’activer la transcription, ce qui est corrélé avec une augmentation de l’interaction avec l’activateur TAF12 (Camuzeaux, 2008).

Nous avons récemment caractérisé une nouvelle isoforme, ATF7-4, localisée exclusivement dans le cytoplasme, qui inhibe les activités transcriptionnelles d’ATF7 et de son homologue ATF2 en séquestrant dans le cytoplasme les protéine-kinases impliquées dans l’activation transcriptionnelle. Suite à un stress, ATF7-4 est ubiquitinylée puis dégradée et les kinases sont libérées (Diring, 2011). ATF7-4 serait ainsi l’équivalent cellulaire d’un peptide dérivé d’ATF2 qui inhibe l’activité transcriptionnelle d’ATF2 et induit l’apoptose des cellules de mélanome suite à un traitement de chimiothérapie.

Notre but est de mieux comprendre ces mécanismes moléculaires et les différents facteurs impliqués dans les transitions SUMOylation/phosphorylation correspondant aux états de répression/activation du facteur de transcription ATF7 dans les cellules tumorales ainsi que les gènes cellulaires ciblés par les différentes formes de ce facteur.

Tout ceci nous permettra de proposer de nouvelles stratégies d’intervention sur les mécanismes de cancérogénèse

Implication des MPT dans la régulation de la synthèse translésionnelle

La synthèse translésionnelle (TransLesion Synthesis ou TLS) est un mécanisme complexe qui permet à la cellule de répliquer son génome malgré la présence de lésions sur l’ADN. Ce processus met en jeu des ADN polymérases - dites ADN polymérases translésionnelles ou ADN pol TLS - spécialisées dans le franchissement des lésions et responsables de la mutagenèse induite par les dommages à l’ADN. Les ADN pol TLS présentent de plus une très faible fidélité lors de la duplication d’un ADN non endommagé et il apparaît donc qu’une régulation fine de leur activité est requise pour maintenir la stabilité de l’information génétique.

L’importance biologique de la TLS est révélée par la maladie Xeroderma pigmentosum variant (XPV) qui confère aux patients une forte probabilité de développer des cancers cutanés dans les zones de la peau exposées au soleil. La maladie XPV résulte d’un défaut de l’ADN polymérase translésionnelle éta, capable de franchir très efficacement un dimère de pyrimidine T-T de type cyclobutane (lésion majoritairement formée après irradiation aux ultra-violets). L’absence de cette activité chez les patients XPV est à l’origine de l’hypermutabilité des cellules après irradiation aux UV, vraisemblablement par l’intervention d’autres ADN polymérases translésionnelles moins fidèles.

Il a été récemment mis en évidence que la régulation de la TLS faisait intervenir une MPT de PCNA, sa mono-ubiquitination assurée par le complexe RAD6/RAD18. cf lienvers le modèle plus détaillé avec le projet et des illustrations

Nos approches expérimentales sont destinées à identifier de nouveaux acteurs, et particulièrement des modifications post-traductionnelles, impliqués dans la régulation de la TLS.

Ceci devrait aboutir à la mise en évidence de nouvelles cibles permettant d’affaiblir ce processus mutagène de tolérance des dommages et ainsi favoriser l’effet toxique des agents thérapeutiques tout en limitant l’apparition de cancers secondaires.

Méthodologies utilisées pour l’étude des MPT

In cellulo :

-  Culture cellulaire de lignées cancéreuses et génération de lignées stables
-  Traitement des cellules avec des siRNA et des molécules chimiques ciblant des kinases
-  Expression de fragments d’anticorps recombinants solubles dans les cellules (intracorps)
-  Transduction d’anticorps entiers à l’aide de lipides cationiques
-  Analyse du phénotype des cellules traitées par microscopie optique et en fluorescence

In vitro :

-  Préparation d’extraits et capture des complexes protéiques associés à la TLS à l’aide d’anticorps ou par liaison à de l’ADN immobilisé
-  Analyse de complexes nucléoprotéiques par Immunoprécipitation de chromatine (ChIP)
-  Analyse de protéines par életrophorèse bidimensionnelle (système DIGE)
-  Mise en évidence de protéines phosphorylées par Western blot
-  Système in vitro de synthèse translésionnelle – production de PCNA ubiquitinée
-  Préparation d’ADN recombinant
-  Application de la recombinaison homologue chez E. coli pour l’obtention de mutants (biologie synthétique)
-  Expression et purification de protéines recombinantes – production de protéines marquées aux isotopes stables 15N et 13C
-  Préparation d’anticorps polyclonaux et monoclonaux
-  Sélection d’anticorps recombinants par la méthodologie dite “phage display”

 

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