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Purification de RCPG et de protéines associées

Études structurales et fonctionnelles de RCPG purifiés et de leurs partenaires

L’obtention de quelques milligrammes de GPCR purifié et actif permet d’étudier leur comportement au niveau moléculaire dans différents environnements, en interaction dynamique avec des protéines partenaires. Produire et obtenir un tel matériel purifié offre aussi d’autres opportunités, de développer un ensemble d’applications telles que production d’anticorps, criblage de ligands ou mise au point d’essais fonctionnels. Dans les meilleures conditions, l’obtention de récepteurs suffisamment purs, homogènes, actifs et stables permet également d’envisager des études cristallographiques et espérer ainsi résoudre leur structure tridimensionnelles, donnant ainsi accès à des données structurales fines et ouvrant la voie à un certain nombre d’applications supplémentaires. La production et la purification de GPCR actif, pur et homogène en grande quantité demeure cependant un exercice particulièrement difficile car il exige non seulement le développement de systèmes de production efficaces et fiables, la mise au point de procédures d’extraction et de purification adaptées ainsi que l’élaboration de stratégies de stabilisation spécifiques.

A l’heure actuelle, les données structurales disponibles pour les RCPG ne concernet qu’une dizaine de récepteur de classe A, la plupart dans une conformation inactive, alors qu’environ 800 RCPG ont été identifiés chez l’homme (Congreve et al. 2011). Le taux de réussite de telles approches est quasiment toujours dépendant du récepteur, si bien qu’il faut adapter les conditions au cas par cas et que des méthodes génériques restent à développer.

Forts de notre expérience passée dans le développement de méthodes et d’outils appliqués à la production, la purification et l’analyse de RCPG recombinants (Singh et al. 2008 ; Alkhalfioui et al. 2009 ; Magnin et al. 2009 ; Michalke et al. 2009 ; Ferndahl et al. 2010 ; Michalke et al. 2010), notre but est d’obtenir des données structurales et fonctionnelles à partir études biochimiques et biophysiques menées sur les protéines d’intérêt du laboratoire (voir projets 1,2 et 3).

 

Références :

Singh et al, 2008, Microb. Cell. Fact. 7, 28

Alkhalfioui et al, 2009, Curr Opin Pharmacol 9, 629-635

Magnin et al, 2009, Protein Expr. Purif. 64, 1-7

Michalke et al, 2009, Anal Biochem 386, 147-155

Ferndahl et al, 2010, Microb Cell Fact 9, 47

Michalke et al, 2010, Anal Biochem 401, 74-80

Congreve et al, 2011, J. Med. Chem. 54, 4283-311

Bornert et al, 2012, Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 29:Unit 29.2

 

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